全国治白癜风最好医院 http://www.xftobacco.com/m/ 前言 丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)感染肝细胞及肝组织是导致脂肪性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因，然而其疾病的发展及调控机制目前仍知之甚少。 年8月，法国斯特拉斯堡大学JoachimLupberger团队联合美国麻省理工大学TomCroonenborghs团队，在消化病顶级期刊Gastroenterology(IF=15.3,年中科院胃肠肝病学一区)发表题为“CombinedAnalysisofMetabolomes,Proteomes,andTranscriptomesofHepatitisCVirus–InfectedCellsandLivertoIdentifyPathwaysAssociatedWithDiseaseDevelopment”的研究文章。 该研究以Huh7.5.1dif细胞HCV感染模型为核心，联合蛋白质组学、转录组学及代谢组学的多组学联合分析方法，探索丙型肝炎病毒感染的相关调控通路；进一步，应用uPA+/+/SCID+/+小鼠肝脏细胞和大量临床配对活检肝脏样本进行验证（包含丙肝感染合并肝硬化、肝癌、脂肪性肝炎等）。 研究发现：丙型肝炎病毒（HCV）感染由过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisomalproliferator-activatedreceptor,PPAR）激活STAT3信号通路，干扰过氧化物酶体（peroxisomalmarkercatalase,CAT）功能，加速葡萄糖代谢，积聚超长链脂肪酸（very-long-chainfattyacid,VLCFAs）及乳酸。上述变化与感染导致的HCV脂肪性肝炎及不良预后密切相关。 正文 HCV感染细胞模型构建蛋白-转录组学联合分析 作者预先使用DMSO诱导分化Huh7.5.1细胞（这类细胞更适合长期培养并且被证明具有与原代人肝细胞相似的表型，且Huh7.5.1dif相较Huh7.5.1具有更强的干细胞特异性marker表达）10天来构建Huh7.5.1dif细胞，并在10天内用HCVcc(Jc1E2FLAG)进行感染模拟HCV感染肝细胞模型（Figure1A），并在各时间点对HCV蛋白质组学（Gut;67:–.）分析（Figure1B-C）。结果证明，在感染后7天内所有HCV相关肽（根据肽段大小分为8类）的表达都大幅提升且表达水平非常接近（Figure1C），因此作者重点对病毒感染前7天细胞的变化进行了转录组学的取样及分析。根据21,个mRNA和8,个蛋白的分析映射，发现7,(90.8%)个蛋白的表达与mRNA相匹配（Figure2A)。 接下来，作者通过个预定义(predefined)的公共数据库基因集（TheMolecularSignaturesDatabasedatabase，MsigDB）与作者的蛋白-转录组学数据（Bioplex）进行交叉比较发现：在HCV感染后7天内，47.4%（个基因集，转录组）以及31.0%（个基因集，蛋白质组）的基因集表达有显著下调（Figure2B）。在大于50genesets[MOU1]的collections[MOU2]中（BIOCARTA,BIOPLEX,KEGG,PID,REACTOME,CORUM,andHALLMARK)，分别有62%的RNA和79%的蛋白表达水平下调。进一步，在mRNA水平出现下调的基因集有83%在蛋白质水平也出现了显著下调。作为对比，仅17%的通路在mRNA、蛋白水平同时上调（Figure2C）。而上调的通路中主要包括了抗病毒反应、炎症反应、前病毒信号通路(SupplementaryFigure3)。上述发现说明：HCV感染通过抑制转录阶段和（或）转录后阶段来阻断非必要的代谢过程，从而保证物质优先用于病毒复制及存活。 Figure1.HCV时间分辨的蛋白-转录组学图谱：(A)Hepatocyte-likeHuh7.5.1dif细胞进行HCVcc(Jc1E2FLAG)处理超过10天。转录组学（绿）、蛋白质组学（蓝）及代谢物组学（黄）的取样时间点如图中对应箭头所示。(B)在感染期间对非感染和模拟感染(mock-infected)组细胞表达的HCV特有多肽的对比定量分析。所有比值根据各个时间点,个不同肽段的中位数进行标准化。FLAG多肽用星号*标出。(C)HCV感染后蛋白的表达在第3天、第7天增加，数据表示形式为一段时间内对应肽段相对于全体肽段数量的相对表达量。红线代表了HCV的复制情况，表示为总HCV多肽表达量的中位数±标准差。 Figure2.持续的HCV感染操纵宿主途径并使先天免疫反应受损。感染7天后的Huh7.5.1dif细胞和模拟感染组(mock)细胞的对比情况。(A)蛋白质vsmRNA相互映射。(B)从MSigDB获得的受HCV感染调控的mRNA和蛋白数据集。(C)HCV病毒感染后上调（红）或下调（蓝）的通路或基因集。 SupplementaryFigure3.HCV持续感染使固有免疫反应减弱感染HCV的Huh7.5.1dif细胞相对于mock感染的细胞（0-7d）：HCV感染患者、人肝嵌合uPA/SCID小鼠肝脏和Huh7.5.1dif细胞蛋白质组学和/或转录组的GSEA。HCV感染可诱导与固有免疫相关基因的RNA转录，但抑制其蛋白质的翻译。NESs以红色（增加）、蓝色（降低）、灰色（无显著变化）和白色（低于分析阈值）显示。肝组织GSEA的统计临界值为Q0.05，对于感染HCV的Huh7.5.1dif细胞为P0.。 持续HCV感染损害过氧化物酶体功能、干扰糖-脂代谢 进一步，作者根据上述GSEA数据，发现过氧化物酶体（peroxisomal，过氧化物酶体参与脂质合成、信号传导、VLCFAs的b-氧化和过氧化氢的解毒）在RNA和蛋白质水平上均明显受到抑制，并在转录组数据库中（25名慢性丙型肝炎感染患者、6名未感染者的肝脏活检标本以及3例丙型肝炎感染嵌合小鼠的肝脏）验证了该发现(Figure3A)。通过比较数据库中HCV感染患者与前述Huh7.5.1dif细胞GSEA发现，后者46个HALLMARK_PEROXISOMEgenesignature[MOU1]的leadingedges[MOU2]都明显下调。其中，11个基因的表达发生显著性改变(Figure3B)。其中，受感染细胞中过氧化氢酶CAT（一种过氧化物酶特异性酶）表达明显受到抑制，形成的过氧化氢酶斑点的数量显著降低(Figure3C)。最后，对例HCV相关早期肝硬化患者以及配对的HCV相关HCC患者肝活检标本中CAT基因表达水平进行分析，结果显示：CAT表达情况与临床转归和表型（child-pugh评分、HCC发病率和生存率）显著相关（Figure6/SupplementaryFigure8）。有趣的是，过氧化物酶体基因在HCC脂肪性肝炎患者的肿瘤和邻近组织中的表达反而降低(Figure6C)，表明过氧化物酶体受损不仅与脂肪肝的发展有关，而且也是反映其葡萄糖依赖性和b-氧化关闭的肿瘤标志（篇幅所限，感兴趣可参详原文）。 Figure3.HCV感染（而不是HBV）抑制Huh7.5.1dif细胞和肝组织中过氧化物酶体的表达：（A）HCV感染损伤与过氧化物酶体功能和脂质稳态相关的代谢途径。25例慢性HCV感染患者与6例非感染个体肝组织RNA-seq数据的GSEA分析，以及Huh7.5.1dif相对于假感染细胞（n=2）的转录组学和蛋白质组学分析。（B）在Huh7.5.1dif细胞和慢性HCV感染患者的肝组织中，11个过氧化物酶体基因的表达被显著抑制（P0.05，Wald检验）。（C）HCV感染的肝细胞样细胞中过氧化物酶体标志物的表达显著下调（P=0.，t检验）。HCVcc感染Huh7.5.1dif细胞3天后的免疫荧光显微镜观察。过氧化物酶体标志物过氧化氢酶（CAT）呈红色，核DNA（DAPI）呈蓝色，HCV（NS5A）呈绿色。比例尺为mm。（D）乙型肝炎病毒感染增强过氧化物酶体功能。HBV感染HepG2NTCP10天（n=3）和原代人肝细胞（n=3）感染HBV40天（基因型D）（GSE）转录组的GSEA。NESs以红色（增加）、蓝色（降低）和灰色（无显著变化）显示。肝组织GSEA的统计临界值为Q0.05，Huh7.5.1dif为P0.。FC，foldchange；NES，归一化富集分数；*具有统计学差异。 （左）Figure6/（右）SupplementaryFigure8.肝过氧化氢酶基因的表达与病毒性和代谢性肝病的临床转归和表型显著相关。 HCV感染后的代谢异常抑制过氧化物酶体功能的具体调控机制 核受体过氧化物酶体增殖体激活受体(nuclearreceptorperoxisomalproliferator-activatedreceptor,PPAR)与过氧化物酶体功能相关，在正常肝脏中高度表达。Figure3A结果提示：HCV感染后有PPAR的mRNA及蛋白水平表达下调。此前研究发现，VLCFAs会激活PPAR-a，而高葡萄糖水平则抑制PPAR-a活性。作者发现，HCV感染后肝细胞链长为20–26碳的极低分子量脂肪酸的细胞内浓度，而较短的脂肪酸(C16–C18)积聚较少(Figure4A)，这与感染期间肝内脂滴的形成(在HCV病毒组装期很重要)和脂肪变性脂质的积聚是一致的（Figure4A）。通过基于质谱的代谢组学分析（代谢组学：Gastroenterology;:–.VLCFAs提取：BrJSurg;60:–.）发现，感染HCV的Huh7.5.1dif细胞中葡萄糖相关代谢产物的显著升高(Figure4B)、葡萄糖消耗显著增加（Figure4C）、乳酸积聚显著(Figure4D)。 进一步，作者用Enrichr（BMCBioinformatics;14:.）预测了HCV感染患者与Huh7.5.1dif细胞的HALLMARK_PEROXISOMEgeneset中85个leading-edgegenes的潜在转录因子；在此基础上，作者加入了11个（Figure3B中结合超过2个leading-edgegenes）转录因子，最后得到15个HCV感染相关参与过氧化物酶体基因转录并被表达下调的转录因子，其中包括了过氧化物酶体增殖激活受体a(PPARA)和其功能伴侣视黄酮X受体b(RXRB)。作者将这些预测的转录因子与蛋白质相互作用数据库HCVpro（proteininteractiondatabaseofHCVhostinteraction）进行比对，正式HCV核心蛋白表达与PPAR-a和RXR-b相关。进一步，作者用WB验证HCV感染确实会抑制Huh7.5.1dif细胞中PPAR-a的表达(Figure5A5B)。 接着，作者使用AMARETTO算法（EBioMedicine;27:–.）分析了HCV感染组和未感染对照组转录组（RNA-seq）数据发现：白介素6受体(IR-6R)可能作为一个与下调过氧化物酶体功能(7个基因)、脂肪酸(12个基因)和脂质代谢(20个基因)相关的功能模块的驱动基因，这表明IL6信号激活因子和转录转导因子3(STAT3)信号通路在调节过氧化物酶体功能中发挥重要作用。事实上，感染激活了STAT3的转录信号(SupplementaryFigure6)，而STAT3的激活导致IL-6R受体转录的快速抑制(Figure5B)可能是机体负反馈调节的一部分。此外，niclosamide(STAT3-inhibitor)对STAT3活性的抑制(Figure5C)使病毒诱导的受抑制的过氧化物酶体基因得以恢复(Figure5D)，表明STAT3信号转导与过氧化物酶体之间存在调节关系。 上述结果表明：HCV感染通过干扰PPAR-a的表达和功能，在不同程度上抑制过氧化物酶体的功能。这影响了脂肪酸和葡萄糖代谢之间的转换，从而导致受感染肝细胞中的葡萄糖依赖和脂质积聚，是慢性肝病和HCC发展的标志。 （左）Figure4.持续的丙型肝炎病毒感染可促进细胞内VLCFA累积和葡萄糖的代谢，并造成乳酸含量的Warburg-like的变化。 （右）Figure5.HCV通过STAT3信号通路抑制PPAR-a的功能来抑制过氧化物酶体基因表达。 结语 全文总结： 1.多组学综合研究分析发现：丙型肝炎病毒（HCV）感染通过过氧化酶体增殖体激活受体（PAPP）激活STAT3信号通路，干扰过氧化物酶体功能（CAT），加速葡萄糖代谢，积聚超长链脂肪酸（VLCFAs）及乳酸； 2.上述变化与脂肪性肝炎及不良预后密切相关； 3.这种蛋白-基因组和代谢图谱有助于确定疾病相关途径的驱动因素作为潜在的治疗靶点。 作者 汪校帅丁长海
