电子衍射技术揭开微小晶体的神秘面纱水木视

BethanyHalford

来自抗癫痫药物卡马西平处于纳米晶体下的微晶电子衍射(Micro-ED)数据可用于确定其三维结构。

年，晶体学家TimGruene从制药企业诺华Novartis的一位科学家处得知，这家制药巨头已经收集了大约万个小分子，但其中仅有约10%的小分子可以用X射线晶体学进行分析：它们的共同点在于，都可以被组装成大型的、高质量的晶体，是X射线晶体学研究的完美样品。X射线穿过这些晶体所衍射的角度和强度可以被计算解析，进而揭示分子的结构。在当时，X射线晶体学是揭示三维空间中分子结构的黄金标准，使研究人员能够准确地了解分子的原子是以何种方式相互连接的。

在Gruene的回忆中，诺华公司的科学家曾提到，另外三分之一左右的分子也是晶体，但它们是粉末，这意味着这些晶体太小，无法进行单晶X射线分析：当用X射线照射时，它们根本无法提供足够的数据。虽然化学家有其他方法来确定一个分子是如何连接的，如核磁共振光谱和质谱，这些方法通过推断的方式来提供连接性，但如果数据模棱两可的话，化学家就会把结构弄错。

对于候选药物来说，错误的结构将引发极大的灾难。当首次制造一个小分子时，若敲定了错误的结构，并试图用不同的化学途径对错误的结构进行还原，就会导致时间和金钱的大量损失。此外，错误的结构还可能致使科学家错误地解读分子在其活性部位的结合方式，从而使改善化合物生物特性的诸多努力付之东流。

EldicoScientific的ED-1独立式电子衍射仪不需要一个全职的操作员Credit

几年后，当Gruene开始一项研究蛋白质的新工作时，他突然想到，如果能够有一项对较小晶体起作用的技术，并以某种方式将分析出的图片进行三维组合的话，诺华公司的科学家们将能够准确地确定“另外三分之一”的分子结构。Gruene的新实验室使用了微晶电子衍射技术(也称Micro-ED)，这种技术的工作原理与X射线衍射类似，但数据的来源是电子(而不是X射线)。由于电子与分子的相互作用比X射线更强，因此有可能从小到纳米的晶体中获得数据，这突破了X射线分析所需的微米级晶体限制。

Gruene认为，他可以利用电子衍射技术来解开存放于诺华公司数据库中的那些粉末晶体的结构秘密。不过，蛋白质在电子衍射实验中的制备难度是众所周知的，于是Gruene将研究重点从蛋白质转向了小分子，特别是小分子药物。不过，Gruene当时没有意识到的是，数十年来，许多其他的研究小组都在尝试着开发能够分析小分子的电子衍射方法。但这项技术还没有被有机和药物化学家以及药企所接纳。

在加州理工学院研究电子衍射技术的有机化学家HoseaM.Nelson说，从20世纪90年代，科学家们就已经开始使用该技术研究小分子了，但该领域的领军人物们"都在力求完美"：他们想要一种能够提供精确的键长和角度的技术。但大多数研究有机分子的化学家们并不追求这些过于细节的信息。对这些科学家来说，电子衍射最有用地方在于，它能提供关于连接性的信息，或者能阐释原子是如何连接在一起的。

Nelson用汽车工程师来作了个比喻。早期的电子衍射研究人员"正试图制造每小时行驶英里的一级方程式赛车，不过，一大群客户需要的只是一辆时速20英里的代步车。这意味着研究人员和客户们并没有建立起有效的沟通。"

年10月，情况有了转机，Gruene的研究小组定制了一台电子显微镜，使它的衍射仪可以对有机小分子的结构进行解析。为了证明这种技术对药物的适用性，研究人员拆开了一粒感冒药胶囊，用电子衍射法解析了胶囊中对乙酰氨基酚(acetaminophen)粉末的结构。(Angew.Chem.,Int.Ed.,DOI:10.2/anie.11318)

在Gruene小组的论文出现在网络上的一天后，一个包括Nelson在内的加州理工学院和加州大学洛杉矶分校的合作团队在预印本服务器ChemRxiv上报告说，他们同样能够利用电子衍射法解决几个有机小分子的结构，包括药物和天然产品。研究人员还分析了四个化合物的混合物，它们都被置于同一个极小的样品收集器上。加州大学洛杉矶分校的TamirGonen，该报告的主要作者之一说："实际上，所有四个分子的结构都可以直接从该混合物中找出，没有任何其他结构生物学方法能够直接从混合物中提供原子分辨率的结构"。这项工作的一篇同行评审论文于次月发表在ACS中央科学杂志上。(，DOI:10./acscentsci.8b)

这两篇文章使有机和药物化学家们注意到了这项技术。从那时起，Micro-ED变得越来越受欢迎。电子衍射技术正在摩拳擦掌，准备在药物化学和其他需要有机小分子结构信息的领域中取得重大进展。

斯德哥尔摩大学的电子衍射专家邹晓冬说："我们已经向整个领域展示了这项技术的重要性和实用性。现在，从事药物研发的化学家们需要这项技术。他们会发现，电子衍射技术使得他们可以用非传统的方式进行药物开发。换言之，这项技术能够用来探索并制造特定的多晶体（小分子可以采取的不同晶体形式）和共晶体。"

在CRO组织NanoImagingServices从事电子衍射工作的JessicaBruhn认为，电子衍射不一定是必要的结构阐明工具，却有它相应的价值："如果你已经有了大晶体，你肯定应该做单晶X射线衍射。这个方法的数据质量很高，设备也便宜得多。因为这是一个非常成熟的领域。不过，当你的材料有限，或在大晶体的生长方面遇到问题时，电子衍射就会大放异彩。"

因为电子衍射分析的对象往往是微小的晶体，科学家们可以在拥有极少量的材料时使用这种技术。加州理工学院的Nelson说："在天然产品的研究中，化学家们费尽心思从植物、细菌、真菌或其他生物体中提取分子，在这个领域，材料的数量和晶体的大小是结构解析的重要限制因素。对化学家来说，动辄从数百公斤的天然产品中提取仅几百毫克材料的苦差事是家常便饭，"几百毫克"是使用X射线晶体学和核磁共振光谱学进行结构分析的最低需求。但是Nelson已经能够使用电子衍射方法来解决复杂分子的结构，仅需几纳克的材料而已。

对于药物化学家来说，电子衍射是一个工具，能够将他们制造的化合物可视化，这最大程度地避免了他们在结构研究中的主观推测。该技术也有助于加工化学家，因为它可以识别多晶型。同一原料药(API)的多晶型可以拥有不同的特性，包括熔点、溶解度和化学稳定性。

一位研究人员正在使用日本理学公司的独立电子衍射仪XtaLABSynergy-EDCredit

诺华公司使用电子衍射技术的科学家GrahameWoollam说，电子衍射可以让科学家们更好地了解那些正在大规模生产的原料药中存在哪些多晶体。"在X射线晶体学中，晶体学家们会挑出一些看起来不错的晶体，但实际上那可能根本代表不了实际应用中的材料。不过，使用电子衍射技术，只需将想研究的材料放在透射电子显微镜的网格上，然后将其置入仪器并收取数据。这就是本质的区别。"

最近，斯德哥尔摩大学和中山大学的研究人员一同合作，使用电子衍射法解决了对非甾体抗炎药吲哚美辛的多形态问题，据研究人员所述，这是一个"47年的误解"。吲哚美辛自年以来一直在市场上销售。年，化学家们发现了该药物的一种此前未被识别的多晶型，并认为这可能是由熔融或溶液结晶造成的。来自斯德哥尔摩和中山大学的团队发现，是结晶的方法导致了两种不同的多形态，其中一种是全新的。这一发现可能对药物的配方产生影响。(Angew.Chem.,Int.Ed.,DOI:10.2/anie.14985)

电子衍射的另一个优势，在于它能够快速扫描样品中的数千颗晶体，找出其中的杂质。Woollam认为这种识别对质量控制和欺诈检测很有用。"其实就是拿一个胶囊，把内容物倒在网格上，然后直接上仪器分析就行了。"

电子衍射还揭示了轻原子的位置，包括氢和锂，这恰恰是X射线晶体学所不能做到的。Woollam说，这些信息对于那些寻求监管部门批准或专利保护的人来说非常重要，因为它能更准确地描述药物的情况。化学家可以看到与氮原子和氧原子相连的氢原子，以及配制药物时经常使用到的的盐类质子。

该技术的影响力甚至延伸到了立体化学。尽管研究人员过去认为这是不可能的，但捷克科学院的晶体学家Luká[gf][/gf]Palatinus和他的同事最近声称，他们可以利用电子衍射来指定一个分子的立体化学排列。据Palatinus说，研究立体化学需要改变数据的处理方式，而不是对实验流程进行改变。Palatinus的团队利用电子衍射解决了丙肝治疗药物索非布韦(sofosbuvir)与L-脯氨酸(L-proline)的共晶体结构--包括立体化学构型。(Science,DOI:10./science.aaw)

Palatinus表示，实验的不断成功正在吸引更多的科学家们加入电子衍射领域："这种方法正在被大力推广，因为它的效果是显而易见的。"此外，一些仪器制造商也注意到了这项技术。赛默飞世尔科技公司现在销售的软件使电子显微镜可以轻易地被改装为电子衍射仪，而且另外两家仪器制造商，EldicoScientific和Rigaku都在销售独立的电子衍射仪。

"电子衍射主要依靠透射电子显微镜进行，这需要很多电子显微镜方面的知识，"Eldico的首席创新官PetraSimoncic说，他成立Eldico公司的目的是研发独立的电子衍射仪，即ED-1。该仪器的优点在于，它不需要使用者了解电子显微镜的调试。研究人员只需准备好他们的样品并将它们放入仪器中。一旦样品进入仪器，只需在交互界面中的各种晶体上收集数据，每个晶体大约需要一分钟。

负责Rigaku理学公司X射线单晶衍射仪销售的MarkBenson说，该仪器受到了热烈的欢迎。"我在Rigaku工作了17年，这是我见过的最具突破性的发展。"

一些研究人员认为这些仪器很贵，Benson给的报价相当模糊，但他也承认这些仪器的价格不菲。据Eldico公司的首席创新官Simoncic估计，Eldico的ED-1仪器价格在万至万美元之间。

加州大学洛杉矶分校的Gonen说："我认为这些公司正在做的事情有一个根本性的缺陷，他们对这些机器的收费太高了。以他们的报价，我完全可以从其他公司买一台电子显微镜，用处反而更多一些。"

对此说法，仪器制造商们不敢苟同。Simoncic表示，一台具有所有最新功能的透射电子显微镜是更加昂贵的，而且运行Eldico的独立衍射仪不需要专门的人员，这减少了维护成本。Benson也补充，这些仪器已经证明了它们的价值。尽管Rigaku的仪器只推出了一年多一点，但用户已经在发表他们用该仪器进行实验的结果。对于那些不想花大价钱投资电子衍射仪的研究小组来说，这两家公司也提供合同服务，研究人员可以把他们的样品送去做电子衍射分析。

成本并不是电子衍射的唯一缺点。Rigaku公司的电子衍射产品经理RobertBücker说，电子只能在真空中传播，这意味着样品必须能够承受真空条件。这对以水合物形式结晶的分子或含有大的溶剂通道的分子来说可能是个挑战。但目前这个挑战是有办法解决的，通常是通过冷冻样品。

而且，电子衍射技术并非好评如潮。普林斯顿大学研究天然产品的MohammadR.Seyedsayamdost最近用电子衍射法确定了海藻上的细菌所产生的灭藻分子结构。(Angew.Chem.,Int.Ed.,DOI:10.2/anie.14022)但他指出，即使该方法能够对极少量的材料起作用，材料的结晶仍然是必要条件。Seyedsayamdost说道："你无法改善你需要晶体这一事实。这只是该方法的一个固有限制，而且这不会改变。"他的小组所研究的天然产品中只有一小部分可以被结晶。

加州理工学院的Nelson近年来一直是电子衍射技术的倡导者，但他也同意该技术有局限性：分析极小晶体的能力是电子衍射技术的魅力所在，但它也可能是一个缺点。这些小晶体可能不能代表整个样品。有几次，Nelson的实验室的化学家在鉴定一种材料时犯了错误，这并非因为他们弄错了结构，而是因为他们实际上看到了一种杂质，或样品中一个非常小的、不相关的成分的结构。

即使存在着这些缺点，化学家们也认同电子衍射技术在所有的解析技术中占据了一席之地。论及这项是否会成为一种主流技术或利基(niche)技术，这仍有待观察。维也纳大学的Gruene说，他已经联系了一些大大小小的药企，并正在帮助他们使用电子衍射来阐明化合物集的结构，探索曾经那神秘的"三分之一"。

水木未来丨视界iss.31

Credit

BethanyHalford

"Electronbeamstakeaimatpharmaceuticals"